蛋白质组学技术发现了重要蛋白好开心，但找不到合适验证抗体好沮丧？这时候靶向蛋白质组PRM闪亮登场！
不需要抗体；
高通量：单次可验证超过50种以上蛋白；
高灵敏度：翻译后修饰也适用；
无物种限制。
下面我们来看看PRM到底是什么？以及它适用的场景吧！
根据是否对目标蛋白进行定量，基于质谱的蛋白质组学定量技术可分为非靶向定量蛋白质组学和靶向定量蛋白质组学。靶向蛋白组学定量主要包括MRM（multi reaction monitoring, 多反应监测）/SRM（selective reaction monitoring，选择反应监测）和PRM (parallel reaction monitoring, 平行反应监测）。
图1：基于质谱的定量蛋白质组学分类
MRM技术基于三重四极杆质谱仪，一次扫描只获得一个子离子的信号。根据理论肽段母离子m/z和碎片离子m/z，选择特异性的母-子离子对（Transition），使得在四级杆（Q1）只筛选指定的母离子通过，进入到Q2碰撞室进行母离子碎裂，然后Q3只筛选指定的碎片离子通过，从而实现筛选（图2上）。
PRM是MRM的衍生技术，技术借助Q-Orbitrap为代表的四极杆-高分辨质谱平台进行数据采集，一次扫描获得该目标离子的所有子离子信号。四级杆（Q1）选出的目标肽段离子，进入碰撞室中打碎，所有的碎片离子经过质量分析器产生完整的二级质谱分析，后期可以通过高分辨一级数据或者提取其中的碎片离子信息实现目标肽段的定量（图2下）。
图2：MRM/SRM和PRM的工作原理[1]
PRM常被称为“质谱领域的WB”，相较于WB，PRM不需要抗体，通量高，一次可以鉴定超过50个蛋白，还可以靶向检测翻译后修饰的蛋白。
相较于传统SRM，PRM的优势是单针方法中增加靶向肽段数量、谱图具有高度专一性、灵敏度更佳，重现性更好，在复杂背景中的抗干扰能力更强。在实际操作方面，PRM比SRM更简单，成本更低，主要表现在：
不需要预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息，节约实验设计和操作时间；
获得的二级质谱信息还可以可靠定性，排除同时间流出物的干扰。
PRM在蛋白质组学研究中应用广泛，但也有很多应用问题被提出，小编为大家摘录如下，方便大家更好的应用这项定量技术：
图3：PRM相对定量/绝对定量的技术流程
问题一：PRM相对定量和绝对定量的应用场景分别是什么？
PRM通过加入内标肽实现目标蛋白质的相对定量和绝对定量。相对定量适用于差异蛋白在不同组别间差异的比较确认。绝对定量中，适用于需要精确获取蛋白质绝对浓度的情况，例如生物标志物的准确定量检测和药物代谢动力学研究等。
在标志物的研究过程中，从发现到验证阶段，蛋白标志物的范围和数量逐渐缩小，PRM的相对定量和绝对定量在不同的阶段发挥作用。
在标志物筛选的早期阶段，通常使用非靶向的蛋白质组学方法来鉴定差异表达的蛋白质，筛选出大量候选标志物。PRM技术的相对定量可以用来过滤发现期差异蛋白质，初步验证（Verification）这些蛋白质在不同样本（如疾病和正常样本）中的差异表达。
标志物筛选的后期通过PRM在更大规模和不同临床研究中心的样品中进行定量检测，减小仪器和临床样品背景干扰带来的分析影响。在这个阶段通过加入重标肽实现绝对定量，精准计算出目标蛋白质的绝对浓度，用于后续临床诊断试剂盒开发和药物开发。
图4：PRM应用于生物标志物验证
问题二：如何挑选PRM肽段？
肽段的特异性：优先选择蛋白质唯一鉴定肽段（Unique peptides），保证定量的高度特异性，避免具有相似序列蛋白质的定量干扰。
肽段的强度：考虑那些在DDA（Data-Dependent Acquisition）实验中得分高且强度高的肽段。提高该肽段在多个样本中的检出率。
肽段的修饰：如果研究的目的是检测特定类型的蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化等），则需要选择包含修饰位点的肽段。否则避免选择修饰肽段（例如甲硫氨酸氧化肽段等）影响蛋白质定量结果。
肽段的漏切位点：排除含有漏切位点（KR）的肽段，以及末端为连续KR的肽段。避免蛋白序列因为漏切出现的冗余定量。
问题三：PRM的结果和Western blot/ ELISA的结果不一致是怎么回事？
PRM和Western blot/ ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是不同的蛋白质定量技术，它们在原理、操作和应用上有所差异，这些差异可能导致它们的结果不一致。Western blot/ELISA是一种基于免疫反应的定量方法，依赖于特异性抗体与目标蛋白质抗原特异性结合，来进行定量分析。尽管操作简单易行，但受限于抗体对目标蛋白序列的特异识别区域。
当蛋白质具有相似序列时，ELISA常不能进行特异性区分，例如对于蛋白质截短体和翻译后修饰形式。但PRM通过特异性选择蛋白质的序列，精准的获得蛋白质的定量结果，因此定量结果和ELISA可能会有不一致的呈现。
研究工作中涉及到蛋白或多肽的靶向定量均可以通过PRM技术来实现，因此在蛋白质组学研究中的应用非常广泛。
神经元和星形胶质细胞衍生的外泌体已被确定为筛选阿尔茨海默病（AD）生物标志物的最佳来源。然而，很少有研究关注从AD血浆中分离出的大量外泌体群体。该研究对血浆外泌体中的328种蛋白质进行了定量,31种蛋白质在AD患者中发生了改变，使用PRM验证了其中12种差异蛋白。基于此开发了逻辑模型，确定六种蛋白组合的诊断能力，表明血浆外泌体的蛋白质组分析可能有助于AD诊断。
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【参考文献】
[1] Sweredoski MJ, Moradian A, Hess S. High-Resolution Parallel Reaction Monitoring with Electron Transfer Dissociation for Middle-Down Proteomics: An Application to Study the Quantitative Changes Induced by Histone Modifying Enzyme Inhibitors and Activators. Methods Mol Biol. 2017;1647:61-69. doi:10.1007/978-1-4939-7201-2_4
[2] Cai H, Pang Y, Wang Q, et al. Proteomic profiling of circulating plasma exosomes reveals novel biomarkers of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2022;14(1):181. Published 2022 Dec 5. doi:10.1186/s13195-022-01133-1
