玉兔捣药是中国神话传说故事之一。见于汉乐府《董逃行》。相传月亮之中有一只兔子，浑身洁白如玉，所以称作"玉兔"。这种白兔拿着玉杵，跪地捣药，成蛤蟆丸，服用此等药丸可以长生成仙。久而久之，玉兔便成为月亮的代名词。
举头望明月，低头做仙方。找到药靶很重要，实验细节很考究。实验浓度与时间选择合适才能快速找到药靶，求得仙方。怎么拿捏这一重要环节，求得“炼丹术”呢？往下看：
这是获取药物使用浓度和孵育时间的直接来源。一般来说，商品化的药物说明书上都会标注药物的贮存浓度、使用浓度以及孵育时间，我们拿到之后应该先看一下厂家怎么说~以脂多糖（LPS）刺激免疫细胞为例，我们查阅说明书可以看到孵育浓度为2 μg/mL，孵育时间为1~3天。可以在此基础上做加减法进行实验找到适合自己的实验条件~
脂多糖（LPS）刺激免疫细胞（数据来源脂多糖（LPS）刺激免疫细胞-流式实验-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific - CN）
当说明书的信息不足以满足特定样本类型的需要时，可以通过文献检索来找到其他研究者在类似实验条件下使用的药物浓度和孵育时间。以Pumbed为例，输入药物及样本类型，选择相关的文章看看前辈们都是怎么做的，以LPS为例，我们输入“lps incubation”和“RAW264.7”，查阅检索到的文章，筛选适合自己的方案。可以在检索汇总的结果的基础上做加减法进行实验找到适合自己的实验条件~
Pumbed文献检索
在缺乏文献指导时，通过预实验来确定药物的最佳浓度是一种实用的方法。首先进行广泛的浓度梯度实验，以识别药物活性的大致范围。然后，根据初次结果，选择一个更窄的浓度区间进行更精细的测试，以缩小最佳浓度范围。
这其中有两个关键衡量指标，那就是半最大抑制浓度（IC50）和半最大效应浓度（EC50），IC50值是指在药物浓度-反应曲线上能够抑制50%细胞活性的浓度；EC50是激活50%靶标活性所需的浓度，这是常用的衡量药物活性的参数。IC50值和EC50值可以作为初始参考浓度，但需根据实验目的和细胞类型进行优化。
在设计药物浓度梯度时，推荐选择6至10个浓度点，包括0浓度对照。这些点应等比分布（2,3,4,5,10等），如以2为基数，则浓度可设为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6等，系统检测细胞的活力，来探索药物效果随剂量变化的关系。
药物剂量梯度预实验
药物浓度效应曲线通常呈现S型或反S型，且在IC50/EC50附近变化最为显著，类似指数增长，因此IC50/EC50的计算通常采用对数转换。此外，IC50/EC50值可能因细胞状态不同而波动，有时变化幅度可达2-5倍，这是实验中常见的现象。
以本图为例，从图中可以看到此药物的IC50为30μg/mL，后续可以以此浓度进行后续实验。
AS-IV的IC50 实验[1]
在药物研究中，孵育时间的选择至关重要，它影响药物的最终效果。
首先应根据药物的作用机制和实验需求进行作用时间的选择，短期作用时间通常为几分钟至几小时，而长期作用时间可达数天。选择合适的作用时间能有效评估药物对细胞生长、凋亡及信号通路的影响。
明确药物作用机制、实验需求以及药物浓度后，设计不同时间点的实验（如0.5小时、1小时、2小时、6小时、24小时等）可以揭示药物效应的时间依赖性（类似药物剂量选择）。
根据数据绘制药物效应随时间变化的曲线，帮助识别药物的峰值效应时间，进而确定最佳作用时间。
在药物作用评估中，可以通过以下实验获取关键数据：
1、细胞实验：
细胞活力检测：MTT和CCK-8等方法用于评估药物对细胞生长的影响，确保药物浓度在有效范围内，避免非特异性细胞死亡。
蛋白和基因表达分析：使用Western Blot、ELISA和qPCR等技术检测特定靶标的表达，了解药物对目标通路的影响。
实时监测：荧光标记和活细胞成像可用于实时观察药物对细胞内结构和功能的影响。
2、动物实验：
血药浓度和药代动力学：测定血药浓度，结合药代动力学（PK）和药效动力学（PD）来优化药物剂量和作用时间。
采样时间点设计：根据药物半衰期和分布动态选择适当的采样时间点（如给药后1小时、6小时、24小时等），以确定最佳剂量和作用时间。
这些方法和设计有助于全面评估药物的效果和优化使用条件。
在确定药物的作用浓度及时间后也要观察药物是否对细胞产生了不必要的毒性，可以采用下面方法进行探究~
细胞毒性实验：在确定药物有效浓度和作用时间的同时，使用MTT、CCK-8、LDH释放等方法评估药物的细胞毒性，确保药物浓度不引起过多非特异性伤害。
凋亡和坏死检测：通过流式细胞术、Annexin V/PI染色等方法检测细胞凋亡和坏死，评估药物是否引发不希望的细胞死亡。
小编的分享就到这里啦~希望对您的科研有帮助！药物预实验不要急，慢慢来，实验最需要的就是静心和耐心~
【参考文献】
[1] Li D, Li G, Chen Y, et al. Astragaloside IV protects ATDC5 cells from lipopolysaccharide-caused damage through regulating miR-203/MyD88 [J]. Pharmaceutical Biology, 2020, 58(1): 89-97.
