2024年10月17日，国际蛋白质组学技术和临床应用领导者Matthias Mann教授团队在顶刊Nature上发表了题为“Spatial proteomics identifies JAKi as treatment for a lethal skin disease”的重大研究成果。该项研究的发布再次展示了蛋白质组学从机制研究到临床治疗方法开发的全流程。学习思路方法,文章和转化成果双赢。
中毒性表皮坏死松解症（TEN）是一种由常见药物引发的致命皮肤反应，患者会因角质形成细胞死亡而出现严重的表皮脱离，其主要驱动因素仍未知，并且没有针对TEN的有效治疗方法。在本研究中作者采用:
1、空间蛋白质组学技术：深度视觉蛋白质组学（DVP）技术，通过单细胞分辨率的蛋白质组学分析了三种严重程度不同的FFPE患者皮肤样品。对角质形成细胞和皮肤浸润免疫细胞中的 5,000 多种蛋白质进行了定量分析，揭示了 JAK/STAT 和干扰素信号通路是 TEN 的关键致病驱动因素。
2、体外和动物实验：体外使用 pan-JAK 抑制剂托法替尼进行靶向抑制降低了角质形成细胞定向的细胞毒性。托法替尼、巴瑞克替尼或 JAK1 特异性抑制剂阿布昔替尼或乌帕替尼的体内口服给药改善了两种不同的 TEN 小鼠模型的临床和组织学疾病严重程度。
3、人体实验：7 例 TEN 患者经JAK 抑制剂（JAKi）治疗后展现出快速皮肤再上皮化和恢复。
深度视觉蛋白质组学（DVP）技术是对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品进行单细胞分辨率的空间蛋白质组学数据分析。采用该技术对轻度（自发性斑丘疹MPR）和重度（TEN或全身症状的药物反应DRESS）的皮肤药物不良反应 （CADR）患者以及健康个体的FFPE 皮肤样本进行了分析（如图1，对 CD45 免疫细胞和泛细胞角蛋白（Pan-CK）角质形成细胞的 FFPE 组织切片进行了染色，然后进行了细胞分割）。
图 1：皮肤药物反应中角质形成细胞的 DVP 工作流程和细胞类型特异性蛋白质组。
a，上图为CADR 中细胞类型分辨蛋白质组学的 DVP 工作流程示意图（n = 21; DRESS、MPR 和健康各 5 个，TEN 共6 个）；下图是每个步骤的代表性图像，包括从FFPE切片切割的角质形成细胞（黄色圈选）和免疫细胞（红色圈选）。b，跨队列角质形成细胞中鉴定的蛋白质数量。c-e，主成分分析，主要驱动因素和PC1的基因集富集分析。f，TEN和健康角质形成细胞中的差异表达蛋白。g，显著差异蛋白聚类。h，Cluster1 的Reactome富集分析。i，补体因子热图。
为了确定疾病和细胞类型特异性的分子机制，首先分析了来自 CADR 的病变角质形成细胞的蛋白质表达谱。角质形成细胞蛋白质组根据药物反应的类型聚集，主成分1（PC1）将 TEN 与其他 CADR 和健康个体分开（图1c）。PC1 与参与钙稳态和细胞应激反应的蛋白 （HSPA5、TMCO1 和 ATP2A2）强相关，GSEA富集分析显示STAT3 是PC1区分能力的主要驱动因素（图1d-e）。与来自健康个体的细胞相比，差异表达蛋白（DEP） 的数量随着 CADR 的严重程度而增加，DRESS 角质形成细胞表达的主要组织相容性复合物 I 类蛋白 TAP1、TAP2、TAPBP 和 HLA-A 的量是健康的两倍以上，表明角质形成细胞积极参与药物相关抗原呈递。
皮肤免疫细胞浸润模式在 CADR 之间存在显著差异。蛋白质组学分析展现了免疫细胞中潜在的分子差异。按疾病表型聚集，但与角质形成细胞相比，PC1 将 DRESS 与其他 CADR 区分开来（图 2）。DRESS中多个病毒通路富集，而TEN 具有干扰素特征，其中 STAT1 是主要驱动因素（图2b-d）。GZMB是细胞毒性的关键介质，在TEN以及非细胞毒性 DRESS 中均高表达（图2f）。
图 2：病变免疫细胞的细胞类型特异性蛋白质组
a，主成分分析，n=5。b，PC1 和 PC3基因集富集评分的散点图。c–e，健康细胞与 MPR （c）、TEN （d） 或 DRESS（e）免疫细胞之间的 DEP。f，差异蛋白在不同疾病状态的丰度。g，显著差异蛋白聚类。h，Cluster1 的Reactome富集分析。
对四个疾病状态免疫细胞DEPs 的聚类得到3个Cluster（图2g）。主要代表 DRESS 的Cluster 2富含 DNA 复制过程，说明DRESS中浸润免疫细胞是增殖性质的。Cluster 1 包含主要与 I 和 II 型干扰素信号相关的蛋白（图2h），在TEN中显著上调，再次证明了TEN 具有干扰素特征。
前面的数据表明干扰素通路在 TEN 中上调，研究者接着利用多重数据非依赖型采集 （mDIA） 工作流程分析了TEN 和 SJS-TEN患者皮肤样品中CD163+ 巨噬细胞、CD4+ T细胞和 CD8+ T 细胞的蛋白质组学数据（图3a）。从每种免疫细胞类型的 20 个细胞中，检测出中位数2,104 个，总共 5,302 个蛋白（图3b）。巨噬细胞中干扰素相关的蛋白表达最高，干扰素介质STAT1显著高于其他两种细胞类型（图3d-e）。
图 3：TEN 中免疫细胞亚型的空间蛋白质组学分析。
a，左图为CD163+巨噬细胞、CD4+ 和 CD8+ T 细胞的 TEN 皮肤组织免疫荧光图；右图为切割轮廓。b-c，所有样品中鉴定出的蛋白质数量和强度。d，干扰素通路蛋白热图。e，免疫细胞亚型的 STAT1 表达。f，巨噬细胞和CD8+T细胞之间的 DEP。g，TEN 样品的免疫荧光。h，在角质形成细胞中鉴定的蛋白数和强度分布。i，显著差异蛋白聚类。j-k，主成分分析及其驱动因素。l-m，在分离细胞与贴壁细胞之间变化的目标蛋白。
研究者进一步分析了来自同一活检中分离（Detached，水疱顶）和附着（Attached，水疱侧）的角质形成细胞之间的空间差异，每种类型和患者仅 20 个细胞（图3g）。在三个Cluster中，最大Cluster的包括补体系统和炎症（图3i）。这些蛋白甚至在TEN附着的角质形成细胞中上调，表明驱动TEN的炎症途径已经在水疱皮肤附近的角质形成细胞中被激活（图3j-m）。
严重炎症性疾病的特征是细胞串扰和反馈回路改变从而加剧免疫反应，细胞类型解析揭示了这种疾病特异性反馈回路。作者假设，在角质形成细胞和免疫细胞中都受到强烈调节的蛋白能鉴别出与治疗相关的通路。与健康对照相比，TEN 的角质形成细胞和免疫细胞中的六种蛋白（WARS1、STAT1、S100A9、LYZ、GBP1 和 APOL2）上调至少四倍（图4a），这六种蛋白都位于干扰素通路中，而干扰素通过JAK / STAT 通路发出信号，因此作者分析了JAK / STAT 通路。STAT1 和 STAT3 在免疫细胞和角质形成细胞中均上调，而 STAT2 仅在角质形成细胞中上调，STAT5 在免疫细胞中上调。大多数干扰素刺激基因 （ISG） 产物要么有效上调，如 GBP1 增加 9 倍，要么仅在 TEN 中可检测到，例如 GBP5（图4b）。
图 4：JAK/STAT 通路在 TEN 中被有效激活。
a，与健康参与者相比，TEN 患者角质形成细胞 （CK） 和免疫 （CD45） 细胞中的 DEP。b， 免疫细胞（左半圆）和角质形成细胞（右半圆）中的 JAK/STAT 通路蛋白。c-d，与健康组织相比，TEN 中所选细胞因子（c）和 JAK/STAT 通路组分（d）的差异表达 mRNA 转录本。e-f，跨队列组织切片中 STAT1 和泛细胞角蛋白（e）和磷酸化STAT1（pSTAT1）。g-h，TEN 的磷酸化蛋白组，STATs的磷酸化位点。
细胞因子激活 JAK/STAT 通路，为了研究其激活，作者在更大的 CADR 患者队列中使用了靶向转录组学。在通过JAK/STAT发出信号的细胞因子的编码基因中，IFNG表达在 TEN 中上调最高。STAT1 的上调表明严重 CADR 具有共同的炎症途径。作者用IF/IHC验证了TEN 患者的皮肤浸润免疫细胞和角质形成细胞STAT1 定位和磷酸化状态，发现 TEN中STAT1定位到核内并激活（图 4e-f）。作者还做了磷酸化蛋白组，发现STAT1有4个位点被磷酸化（图4g-h）。总的来说，这些结果表明 JAK/STAT 通路的激活是 TEN 的关键驱动因素。
为了探究这些发现的临床意义，研究者开发了一种新的体外模型来真实地复制皮肤药物反应。在这种自体共培养模型中，活化的PBMC在 72 小时内杀死角质形成细胞，且可以被 pan-JAK 抑制剂Tofacitinib以剂量依赖性方式抑制（图5a-c）。
图 5：JAK/STAT 抑制可降低体外和体内 TEN 的严重程度
a-b，活细胞成像分析。c，口服药物方案。d-j、临床评估（d、g、h）、组织学（e）、真皮厚度（f ;每只小鼠 15 次测量）、病变大小（i）和体重变化（j）在治疗前（d-g）和治疗模型（h-j）。k，TEN 人源化小鼠模型中口服 JAKi 治疗的示意图。I-n分别是药物治疗前后的眼反应，疾病发生率和上皮下细胞死亡百分比的比较图表。
研究者接下来进一步评估了口服 JAKi 在已建立的 TEN 小鼠模型中的疗效。用 pan-JAK 抑制剂Tofacitinib或 JAK1 和 JAK2 抑制剂Baricitinib口服治疗在治疗的第 1 天和第 3 天成功降低了肉眼可见的疾病严重程度（图 5d）。可检测到皮肤磷酸化 STAT1 增加的信号在 JAKi 处理后显着降低（图5e）。平均真皮厚度恢复到正常水平（图5f）。JAKi 减少了角质形成细胞的死亡，并且减少了免疫细胞浸润。JAKi 处理的小鼠的表皮恢复加速（图5 g-i）。
研究者进一步在已建立的 TEN 人源化小鼠模型中测试了Baricitinib的疗效，该模型将 TEN 患者的 PBMC 静脉注射到免疫缺陷小鼠中（图 5k），发生严重的眼结膜炎和结膜上皮细胞死亡。Baricitinib治疗显着减少了眼结膜炎和结膜上皮细胞死亡（图 5 l-n）。总之，体外和体内数据证明了 JAKi 在 TEN 临床前模型中的疗效。
根据前期良好的实验结果，研究者们开展了 7 名 TEN 或 SJS-TEN 重叠的患者治疗探索。其中一位 59 岁的小细胞肺癌男性正在接受卡铂、依托泊苷和 PD1 拮抗剂斯鲁利单抗治疗（图6）。在第三个周期的癌症治疗后发展为 TEN，表皮脱离影响了 35% 的体表，疾病严重程度评分（SCORTEN） 为 4，表明预测死亡率为 58.3%。尽管静脉注射大剂量激素，但表皮脱离仍在进展。使用Abrocitinib进行 JAK1 抑制剂挽救治疗，在2天内TEN停止进展，4天内可见再上皮化，16 天后达到接近完全（95%），患者在 TEN 完全康复后出院。这 7 名接受 JAKi 治疗的患者在第30天都存活且无副作用。值得注意的是，在 JAKi 治疗后，这 7 名患者的皮肤磷酸化 STAT1 水平均显著降低。这些临床数据显示了 JAK1 或 pan-JAK 抑制治疗 TEN 的潜力。
图 6：JAK/STAT 抑制对 TEN 患者的有益影响。
与癌症治疗相关的 TEN（SCORTEN 4）患者的病程。在大剂量静脉注射甲泼尼龙治疗期间观察到TEN进展，患者出现持续性高血糖。第4天开始使用Abrocitinib挽救治疗，在48小时内停止进展，在4天内再上皮化。
研究者利用DVP技术，对药物诱导的皮肤反应患者的 FFPE 皮肤切片中角质形成细胞和免疫细胞的空间蛋白质组进行了分析，对每种细胞类型多达 5,000 种蛋白质进行了定量分析。对治疗干预CADR 的分子机制提供了重要见解。
研究发现TEN 中 JAK/STAT 通路的显着上调，该信号通路被研究中一系列实验证实是皮肤炎症、角质形成细胞细胞毒性和表皮脱离的主要驱动因素。然后全面研究了 JAKi 在一种新型细胞培养模型中的体外效果和在两种独立小鼠模型中的体内效果，所有这些模型都显示出一致的治疗益处。最后临床治疗了 7 例 TEN 或 SJS-TEN 重叠综合征患者，所有患者对 JAKi 反应良好，治疗后完全康复出院。这些数据为 TEN 早期 JAKi 疗法的临床试验铺平了道路，有可能改变这种致命不良反应对常见药物的结果。
亮点：该研究是将新兴的细胞类型分辨空间组学技术，与一种对患者有益的新治疗方式直接联系起来的成功案例。类似的方法可以通过帮助确定关键的可成药靶点并更精确地选择治疗方法，在广泛的炎症或肿瘤疾病中产生变革性的转化研究意义。
mg不朽情缘官网空间蛋白质组学项目在国内外学术界引起了广泛关注。2022年7月，mg不朽情缘官网与中国医学科学院北京协和医院合作，在《Nature Communications》上共同发表了国内首篇关于空间蛋白质组学的研究论文“Spatially resolved proteomic map shows that extracellular matrix regulates epidermal growth”，为国内空间蛋白质组学的研究树立了新的标杆。
